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                    Trizol试剂提取DNA的实验方法
                    双击自动滚屏 发布者:dindin 发布时间: 阅读:4105

                    Ø      操作步骤:

                     

                    Trizol试剂匀浆细胞和组织的方法同RNA提取步骤。

                    在细胞匀浆中加入氯仿,每1ml Trizol的起始用量加入0.2ml氯仿。剧烈震荡30秒钟后室温放置2~3分钟。

                    410,000g离心10分钟。

                    小心吸取并丢弃上层水相(该水相中富含细胞总RNA,如果需要提取RNA,则收集该水相)。如果水相清除?#24576;?#24213;,将可导致提取的DNA中混杂有RNA

                    在剩下的中间层及有机相中加入无水乙醇,每1ml 起始Trizol用量加入0.3ml无水乙醇。颠倒充分混匀后室温放置2~3分钟。

                    42,000g离心5分钟。

                    小心吸取并丢弃上层的酚醇有机相,沉淀?#27425;?/SPAN>DNA。将DNA沉淀?#20204;?#27927;?#28023;?/SPAN>0.1M柠檬酸钠,10%乙醇)清洗2次。每1ml 起始Trizol用量的沉淀DNA加入1ml清洗?#28023;?#22312;每次清洗过程中,DNA沉淀保存于室温清洗液中30分钟,期间震荡数次,然后42,000g离心5分钟。弃去上层液相。

                    注:如果DNA沉淀量较多。大于200mg,或含有较多量的非DNA物?#21097;?#21487;以用上述清洗液多清?#37255;?#27425;。

                    数次清洗后,DNA沉淀用75%乙醇悬浮,每1ml 起始Trizol用量的DNA沉淀用1.5~2ml 75%乙醇悬浮,在室温下放置10~20分钟,期间震荡数次,然后42,000g离心5分钟。弃去上层液相。

                    打开管盖,空气干燥DNA沉淀5~15分钟,加入?#23454;?#20307;积的8mM NaOH溶液悬浮DNA沉淀(该方法提取的DNA难?#21248;?#20110;蒸馏水或Tris-Cl缓冲液中,故推荐采用8mM NaOH溶解DNA。?#38376;?#24230;的NaOH溶液pH约为9DNA溶解后,容?#23376;?/SPAN>TE缓冲液或者HEPES调校pH)。8mM NaOH DNA悬浮液中可能含有不溶性的凝胶状物?#21097;?#22914;细胞膜碎片等)。以>12,000g的速度离心10分钟去除不溶物,上清液转移到一支新的收集管中。溶解于8mM NaOHDNA可在4下存放过夜。如果需要延长保存时间,需要用HEPES将溶液的pH调校至7~8,并在溶液中加入EDTA至终浓度为1mMpH调校好的DNA溶液可存放于4-20

                     

                    ²       DNA溶液的应用:

                     

                    PCR扩增DNA

                    DNA溶解于8mM NaOH后,用0.1mM HEPES调校pH8.4(参考下表调校)。在PCR反应体系中加入0.1mg~1mg DNA作为模板,按标准程序完成PCR

                    ②限制性核酸内切酶反应

                    DNA溶解于8mM NaOH后,用HEPES调校至?#23454;?/SPAN>pH(参考下表调校)。或者DNApH 7~81mM EDTA溶?#21644;?#26512;。?#30422;?#21453;应体系中,每1 mg DNA加入3~5 U酶,缓冲液采用酶供应商推荐的特定配方,?#30422;?/SPAN>3~24小时。一般来说,80%~90%DNA都可被限制性核酸内切?#30422;?#21106;。

                     

                    ²     溶于8mM NaOH DNA溶液pH调校方法:

                    1ml8mM NaOH DNA溶液加入以下体积的0.1M HEPES1M HEPESfree acid

                     

                    目标pH

                    0.1M HEPES用量(ml

                    目标pH

                    1M HEPES用量(ml

                    8.4

                    86

                    7.2

                    23

                    8.2

                    93

                    7.0

                    32

                    8.0

                    101

                     

                     

                    7.8

                    117

                     

                     

                    7.5

                    159

                     

                     

                     
                     

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