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                    PCR技术的相关应用
                    双击自动滚屏 发布者:dindin 发布时间: 阅读:4030

                    PCR技术在突变基因检测方面的应用

                    自从1985PCR技术首次应用于遗传病基因诊断以来,已有近百种遗传病可用PCR 技术进行诊断和产前诊断,利用PCR技术诊断遗传病的途径有五个:

                    ①基因突变位点的直接检出;

                    ②筛查与遗传病;

                    ③有关的点突变;

                    ④遗传多态?#21592;?#35760;连锁分析间接诊断;

                    ⑤利用mRNA逆转录为cDNA进行分析或直接分析mRNA

                      传统的基因诊断技术主要是以基因探针技术为基础而建立的一些检测方法,包括 SouthernNorthern印迹杂交等,它们可直接分析基因的缺失或重排,亦可结合利用RFLP技术实行连锁分析。但由于这些技术操作繁琐,探针来源困难所需试剂昂贵,且要用放射性同位素。完成一项诊断需要的时间亦较长,因此难于满足临床诊断的要求。限?#23631;?#23427;在临床上的应用。PCR技术是一种在体外的酶促DNA合成技术,它能在短时间内将靶DNA 扩增百万倍,而且操作简便,省时,准确性也高,它不仅能直接检测突变基因,而且可与其它技术结合,使其诊断的准确性可达100%,而且不用同位素操作,能最大限度的满足临床诊断的需要,因而它已成为目前遗传病诊断、产前诊断的主要手段。

                    (一)、PCR技术诊断遗传病的基本条件

                      PCR技术的基本原理是利用一对引物为介导,在体外模拟天然DNA复制过程的技术,从生化的角度来看,它是一种酶促反应,因此其反应的过程中必须有酶的底物,在这里酶为DNA聚合酶,该酶有耐热性,底物为4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTPs)。它所需要的另一条件为引物,引物是根据已知的基因片段合成的一段含约20个核苷酸的目的基因互补序列,因此,要进行PCR检测,除?#21496;?#22791;酶,底物及其它基本因素外,利用已知的基因结构合成一对引物是PCR诊断遗传病的最基本条件,?#31807;?#26159;说,该遗传病的基因结构必须部分或全部清楚。

                    (二)、利用PCR技术诊断遗传病的途径

                    1PCR技术直接诊断遗传病

                      对于由基因缺失突变引起的遗传病可利用缺失区域两侧的DNA序列引物直接扩增该区域,看有无特异性的扩增产物,这对缺失部位固定的片段检测非常准确简便,只需一对引物?#32431;?#23436;成,而对于那些缺失部位不确定的基因则可利用多对引物进行多重 PCR,然后检查缺失带。对基因的重排来说,可通过用RT-PCR检测mRNA的融合情况来检出,基因插入亦可用PCR方法来检出,当点突变影响到限制内性切酶切点时,可用PCR-RFLP进行分析,即将扩增产物用?#23454;?#30340;内切酶切割,然后据电?#23601;?#35889;判断有无酶切位点的改变,它比传统的RFLP检测法快速简便,且不受同位素的危害。若突变位点及性质已知,可用PCR-ASO3'特异PCR及引物竞争法进行确定,而对于突变位点不清楚或突变位点多变的基因则可用PCR-SSCPDGGECDGETGGEPCR-RNSE切割,化简错配切割,异源双链分析长久法进行筛选与遗传病有关的点突变,再用PCR循环后直接测序确定突变部位和性?#30465;?SPAN lang=EN-US>

                    2、利用连锁分析间接诊断遗传病

                      有的遗传病基因结构庞大,基因的分子病理改变复杂或不清楚,或异质性较高,利用PCR技术直接检测与遗传病有关的基因点突变有一定的困难。常常利用一些基因内或其旁侧的一些多态?#21592;?#35760;进行连锁分析,以间?#20248;?#26029;遗传病,常以PCR方法进行检测的多态?#21592;?#35760;有以下两种:

                      (1PCR-RFLP

                      在人类基因组中存在?#21028;?#22810;限制?#38405;?#20999;酶切点,这些切点在人群中具有明显的遗传多态性。因此可用已知DNA序列的基因内或其旁侧序列中的酶切位点多态性以PCR方法来检测。PCR扩增后用相应的内切酶进行切割相应的扩增产物,通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行电泳,分析酶切位点多态性。需要注意的是,在用PCR-RFLP进行连锁分析时应选择那些杂合频率多,即具有较高多态信息量的酶切位点。

                      (2Amp-FLP

                      在人类基因组中,除RFLP可作为遗传标记外还有一有用的多态?#21592;?#35760;,即VNTR(数目可变的串联重复序列),和STR(短的串联重复序列)VNTR的特征是其重复的核心区内的串联重复单位为6-40nt,重复片段大小在不同个体有所不同,重复?#38382;?#21464;化亦较大,一般在几次到上百次之间。STR的核心重复单位为2-5 nt时,其中由双核苷酸重复(CA)n(GT) n(n10-60)构成的串联重复称为VNTR。有意义的是,这些串联重复序?#24615;?#20154;群中具有高度的遗传多态性,人群中的杂合子比例在50%以上,最高的可达90%以上,因此它仍可提供更多的多态信息量。VNTRSTR可用其两端的序列合成引物,用PCR进行扩增,PAGE+银染即Amp-FLP。加之这些片段呈?#31995;?#23572;式遗传,因此用之作为连锁分析的标记具有重要价值。目前Amp-FLP已广泛应用多种遗传病的连锁分析如DMD/BMDDKU?#21462;?#26368;近几年的研究还发现,核苷酸重复的长?#32570;?#24322;可导致许多人类疾病。目前已证实的的与人类疾病有关的致病性重复关联核苷酸有脆性X?#26087;?#20307;综合征 (CGG)>52,肌强直性营养不良DM(CTG)>50;X连锁脊髓和延髓肌萎缩(CAG)HD(CAG)当。利用串联重复区所测序列合成的引物?#32431;?#23545;这些遗传病进行基因诊断。

                    (三)、PCR技术在产前诊断中的应用

                    1PCR技术在产前诊断中的地位

                      传统的产前基因诊断主要依赖于以探针为基础的Southern blottingRFLP,以此可诊断缺失型突变及个别的点突变。但由于其操作的复?#26377;?#21450;仪器设备的限制,耗时长,准确性不高,?#34892;?#21516;位素标记,因而大大的限?#23631;?#23427;的应用。自从80年未PCR技术而始应用于产前基因诊断以来,随着该技术的发展,愈来愈受到人们的重视?#31361;?#36814;,就目前来看,它已成为遗传病产前基因诊断的最常用技术。以此技术为基础的各种突变基因检测方法已成为遗传病基因诊断的主要手段。

                    2PCR产前基因诊断的途径

                    1)、产前基因诊断胎儿标本的来源

                      由于PCR技术?#26087;?#30340;特点,?#32431;?#22312;短时间内将微量的DNA扩增数百万倍,因此它适应于各种来源的DNA标本。

                      ①羊水穿刺,在如15周后可经母亲脆壁穿刺获羊水,其内含有大量的胎儿脱落细胞,5-10ml羊水?#32431;?#33719;得足够量的PCR分析DNA样品;

                      ②绒毛采样,在如早期(9-12)经阴道在B超引导采取绒毛样品,它含有丰富的DNA

                      ③胎儿血液采集:有简便途径如胎儿脐静脉穿刺,胎儿镜采集;

                      ④胎儿活检:可用穿刺取样,亦可经胎儿镜取样。可在始17-19周进行;

                      ⑤母外周血分离胎儿细胞,目前已用于胎儿?#21592;?#30340;预测;

                      ⑥宫颈刷取细胞;

                      ⑦着床前取细胞。

                    2)、DNA的抽提:不同组织来源有其不同的提取方法。

                    3)、DNA的扩增及检测

                    根据不同的突变及检测目的采用不同的检测方法,但需要注意的是防止污染造成的假阳性结果。目前利用PCR技术能进行产前诊断的遗传病有多种,常常采用多种方法联合应用,如PCRSouthern印迹杂交联合应用等,以求最大限度的精确。

                     

                    ►PCR技术在其它方面的应用

                    1、骨肿瘤诊断

                    骨肿瘤较罕见,恶性骨肿瘤只占全身恶性肿瘤的1%,男多于女,?#21592;?#27604;约为1.6 1,均好发于10-30岁间,良性者以骨软骨瘤最多,?#26469;?#20026;骨巨细胞瘤、内生软骨瘤等,恶性者以骨肉瘤最多,?#26469;?#20026;软骨肉瘤、?#23435;?#32905;瘤?#21462;?#39592;恶性肿瘤的发生机理目前认为?#21069;?#22522;因显性作用与抗癌基因失活的结果,是多种癌基因多阶段多途径协同作用的结果。骨恶性肿瘤转移涉及到肿瘤细胞自身与宿主细胞之间错综复杂的关系,受多种相关基因的调控,即肿瘤的转移与转移基因和转移?#31181;?#22522;因有关,与生长因子及其受体的表达以及某些癌基因产物有关。因此,通过对活化的癌基因及抗癌基因改变的检测,可以快速分析患者肿瘤的易?#34892;?#21450;判断肿瘤的预防;检测耐药基因的表达程度,可为肿瘤的诊治提供方案选择的依据;通过对转移基因?#30333;?#31227;?#31181;?#22522;因的检测,可以判断肿瘤有无转移,对手术治疗案提供依据。

                      PCR技术是一种快速诊断技术,具有敏?#23567;?#29305;异、专一性强等特点,在骨肿瘤诊断及研究方面具有其它方法难?#21592;?#25311;的优越性。

                    2、遗传病诊断

                    自从1985PCR技术首次应用于遗传病基因诊断以来,已有近百种遗传病可用PCR 技术进行诊断和产前诊断,利用PCR技术诊断遗传病的途径有五个:

                    ①基因突变位点的直接检出;

                    ②筛查与遗传病;

                    ③有关的点突变;

                    ④遗传多态?#21592;?#35760;连锁分析间接诊断;

                    ⑤利用mRNA逆转录为cDNA进行分析或直接分析mRNA

                      传统的基因诊断技术主要是以基因探针技术为基础而建立的一些检测方法,包括 SouthernNorthern印迹杂交等,它们可直接分析基因的缺失或重排,亦可结合利用RFLP技术实行连锁分析。但由于这些技术操作繁琐,探针来源困难所需试剂昂贵,且要用放射性同位素。完成一项诊断需要的时间亦较长,因此难于满足临床诊断的要求。限?#23631;?#23427;在临床上的应用。PCR技术是一种在体外的酶促DNA合成技术,它能在短时间内将靶DNA 扩增百万倍,而且操作简便,省时,准确性也高,它不仅能直接检测突变基因,而且可与其它技术结合,使其诊断的准确性可达100%,而且不用同位素操作,能最大限度的满足临床诊断的需要,因而它已成为目前遗传病诊断、产前诊断的主要手段。

                    3、苯丙酮尿症诊断

                    经典型的苯丙酮尿(Phenyketon uriaPKU)是由苯丙氨酸羟化酶(PAH)的遗传性缺陷引起的一种先天性代谢病,其发病早,在我国以为1/10000左右,杂合子频率为 1/50

                    PKU的临床表现为PKU患儿由于苯丙氨酸羟化酶的缺乏或活性下降使苯丙氨酸在体内大量堆识,并经旁?#21453;?#35874;途径产生一系列的毒性代谢产物而使小儿产生一系列的明显中?#23616;⒆础?#24739;儿在刚出生时,由于无苯丙氨酸的摄入而无临床表现。随着患儿的进食而连续出?#31181;?#21147;进行性下降,皮肤色素?#24120;?#32908;张力高,惊厥发生,汗和尿中有特殊的臭味,最后生活不能自理,智力严重障碍。

                    PKU是一种常?#26087;?#20307;隐性遗传病,患儿的?#25913;?#20026;致病基因的携带者而患儿为纯合子。引起PKU的基因是PAH,该基因位于12q22-24.2全长约90kb,包括13个外显子和12 个内含子。内切酶解分析显示PAH的完整cDNA其有8个限制?#38405;?#20999;酶切点,形成10 RFLP。在人群中这些RFLP可组成1536种单倍型。过去对PKU的诊断即用此连锁分析。另外在PAH基因内含有数个VNTRSTR。外显子3'700bp处有一(TCTA)重复序列,外显子133'端下游3kb内有一30bp VNTR,它们仍有复杂的遗传病多态现象,可作为连锁分析时的标记。

                    PAH基因的突变常见的有两种类型即缺失和单碱基置换,在我国人群中,已检测的PKU均因PAH基因的单碱基置换所致。目前在我国其检出了15种以上的点突变,这些点突变在我国南方和北方人群中的频率有的不同。因此在PKU的诊断中注意这种差别。

                     

                     
                     

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